1. Введение
На сегодняшний день кариес – самое распространенное заболевание, не имеющее тенденции к уменьшению роста. Изучая причины возникновения кариеса зубов, многие ученые ведущую роль отводят стрессовым факторам [1, С. 58], [2, С. 191–201]. Впервые концепцию стресса в стоматологии применил Г. Селье [3, С. 355–367]. Стресс способствует развитию стрессорных нарушений в тканях челюстно-лицевой области, в том числе и в тканях зуба [4, С. 1–21]. Предположив, что стресс является основополагающим фактором возникновения кариеса, мы не должны останавливаться на каком-то одном виде стресса. В свое время В. Р. Окушко выдвинул гипотезы, согласно которым пульпа влияет на развитие кариозного процесса в зубе [5, С. 64]. Представляется интересным изучить возможную взаимосвязь между стрессовым фактором и вероятность патоморфологических изменений в тканях зубов.
Цель исследования: изучить патоморфологические изменения, происходящие в тканях зубов в результате воздействия на организм крысы различных стрессовых факторов.
2. Методы и принципы исследования
В исследовании были использованы белые беспородные крысы возраста 7-8 месяцев, массой 150-250 г, которые содержались в клетках по 4-6 особей, в условиях 12 часового цикла светлое/тёмное время (включение света в 7.00) со свободным доступом к воде и пище. Животные были разделены на группы по 6 животных в каждой. Во трех группах вызывали стресс у животных. У первой группы при помощи пятидневного плавательного стресса вызывали поведенческую депрессию и проводили ведение R-86 с имипрамином по 5 мг/кг. R-86 (спиро-[индол-3,1'-пиррол [3,4-с пиррола]) и имипрамин вводили по 5 мг/кг внутрибрюшинно для терапии поведенческой депрессии в течение 20 дней. Уровень депрессивности крыс оценивали путем регистрации параметров показателей плавательного теста Порсолта (ПТП) [6, С. 291–294]. Крыс помещали в плексигласовый цилиндр диаметром 46 см и высотой 45 см, заполненный водой (температура 23-25°С) до уровня 30 см от дна. В 1-й день продолжительность плавания – 15 минут (претест); через 24 часа – 6 минут и регистрировали основные параметры поведения с помощью видеосъемки и хранили их в виде отдельного файла. Поведение иммобилизации характеризовалось вертикальным расположением крыс, отсутствием движений, передние лапы прижаты к груди, задние лапы вытянуты, голова держалась над водой. Чем больше продолжительность иммобилизации, тем выше уровень депрессивности животных. Депрессивный синдром моделировали по методу P. Sun [7, С. 16464–16472].
У второй группы животных моделировали стресс, вызывая асептическое воспаление путем подкожного введение крысе в мягкие ткани спины флагогена (0,5 мл 9% раствора уксусной кислоты) с одновременным внутрибрюшинным введением реополиглюкина (300мг/кг) [8, C. 440]. Уже на 1-е сутки в месте инъекции кислоты развивалась воспалительная реакция, а очаги некроза образовывались к концу 3 суток. На 7 сутки приступали к исследованию. Внутрибрюшинно животному вводили R-86 с имипрамином по 5 мг/кг.
Третья группа крыс подвергалась фармакологическому, в частности гормональному, стрессу. В организм крысы вводили дексаметазон в адекватной терапевтической для человека дозе 0,25 мг/кг веса в течение 30 дней 1 раз в 2 дня.
Контролем для подтверждения изменений после стресса служили 6 животных, не получавших стресс и медикаменты. Всего в эксперименте участвовали 24 животных.
Для морфологического исследования использовали биоптат центрального резца и мозга самцов белой беспородной крысы, полученный в результате декапитации животного. Эвтаназию проводили после введения препаратов кетамин с дроперидолом внутрибрюшинно с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Исследования проводились с согласия комиссии по биоэтике ДонНМУ от 15.11.2016 г. № 43/16 Министерства Здравоохранения ДНР.
Извлекали фрагменты челюстей, после чего помещали их в 10% нейтральный буферный раствор формалина (ФМ, высший сорт, ГОСТ 1625-89) на срок, составляющий в среднем 7 дней. Фрагменты челюстей затем последовательно высушивали в ректификованном этиловом спирте (марка «Экстра», ГОСТ 18300-87) с возрастающей концентрацией с шагом в 10%, начиная от концентрации 50% и заканчивая 96% концентрацией с экспозицией 20 минут. В дальнейшем образцы хранились в погруженном виде при температуре от 0°C до 4°C. Срезы из полученного материала ткани нарезали на микротоме МПС-2 толщиной 4-5 мкм и натягивали на стекла. Сушили 12 часов при tо 37оС. Высушенным срезам проводили депарафинизацию. Делали шлифы удаленных зубов с последующим их исследованием на световом микроскопе Olympus BX-40 позволяющим получать увеличение х400.
3. Основные результаты
В процессе исследования в зубах крыс, получивших стресс, были обнаружены патоморфологические изменения. В пульпе зуба присутствуют изменения воспалительного генеза. Гиперемия, некроз пульпы. Много сосудов мелкого калибра. Наблюдаются перецеллюлярный и интерстициальный отеки, разрастание волокнистой соединительной ткани с коллагеновыми волокнами (рис. 1 а). Клеточный инфильтрат содержит в основном лимфоциты, фибробласты. Реже встречаются плазмоциты, единичные сегментоядерные клетки. Наблюдается дефицит нейтрофилов. Выраженная пролиферация одонтобластов. В одонтобластическом слое обнаруживались единичные лимфоциты. Разрастание волокнистой соединительной ткани преобладало в центральной части пульпы. По периферии пульповой камеры наблюдали клеточный инфильтрат, включающий некротизированные безъядерные клетки, внедряющийся местами в плотные ткани зуба – не измененные дентинные канальцы.
В группе крыс с гормональным стрессом пульпе наблюдали пролиферативное воспаление. Клетки в основном незрелые, ядра крупные с узким ободком цитоплазмы. В центре пульпы созревающие фибробласты, а по периферии молодые. Местами очаги кровоизлияния, видны сосуды. Тканевой состав пульпы представлен рубцовой волокнистой соединительной тканью пронизанной фибробластами округлой формы с крупными ядрами. Размеры ядер к центру пульпы постепенно уменьшаются, клетки становятся вытянутой формы с заостренными концами. Это свидетельствует о том, что фибробласты созревают в фиброциты, содержащие много коллагена. Мы наблюдаем разрастание волокнистой соединительной ткани, по сути рубцовой.
Умеренное воспаление в пульпе с разрастанием рыхлой волокнистой соединительной ткани и мелких сосудов: а – отек пульпы; б – зубодесневой карман с умеренным воспалением в мягких тканях; многослойный плоский ороговевающий эпителий
Периодонт первой группы крыс без патологических изменений. Представлен волокнистой соединительной тканью с фибробластами, коллагеновыми волокнами. У второй группы крыс в тканях периодонта хроническое воспаление с разрастанием грануляционной ткани, созревающей в волокнистую соединительную ткань (рис. 1 б). Местами преобладала волокнистая соединительная ткань по существу рубцовая. Видны фибробласты. В периодонте небольшое число клеток воспалительного инфильтрата. Периодонтальная щель местами расширена. В периодонте подлежащем к цементу зубов крыс, получавших дексаметазон, были обнаружены более молодые клетки с ядрами полигональной, округлой формы, а ближе к периферии преобладают фибробласты более вытянутой формы, которые вырабатывают коллаген. Это рубцовая волокнистая соединительная ткань. Фиброзная ткань в периодонте является результатом воспаления.В зубах контрольной группы крыс в пульпе разрастание соединительной ткани с лимфогистиоцитарной инфильтрацией ближе к режущему краю резца. В периодонте по периферии разрастание фиброзной ткани в области зоны роста зуба. Это относилось к постоянно растущим резцам и носило физиологический характер. Клеточный лимфогистиоцитарный инфильтрат ближе к корню. В периодонте молодые фибробласты, созревающие по периферии. Пролиферация фибробластов в периодонте.
4. Обсуждение
В состав плотной волокнистой соединительной ткани входят гликозаминогликаны и протеогликаны, влияющие на тургор и дифференцировку тканей, обменные процессы. Фибробласты участвуют в образовании соединительнотканного матрикса. Изменения, происходящие в пульпе зуба крысы, перенесшей стресс, свидетельствуют о том, что мы наблюдаем развитие кариозного процесса по аутоимунному типу. Вследствие нейтрофилопоэза воспалительный процесс в условиях стресса приобретает затяжной характер, что является одним из механизмов снижения резистентности организма. Лимфоциты – основные клеточные элементы иммунной системы. Они являются истинными иммунокомпетентными клетками участвуют в гуморальном и клеточном иммунитете [9, С. 576]. Лимфоцитоз свидетельствует о том, что в условиях стресса в кровь происходит выброс тимусных и костномозговых лимфоцитов, которые должны заселить Т- и В -зоны в периферических лимфоидных органах [10, С. 21]. В конечном итоге это приводит к нарушению иммунных реакций.
Внедрение клеточного инфильтрата в дентинные канальцы свидетельствует о развитии в пульпе зуба иммунной реакции. Это наблюдалось на отдельно взятом небольшом участке. Это наводит на мысль, что именно в этом участке впоследствии разовьется кариозное поражение. И начинается оно не снаружи зуба, а с изменений в клеточной структуре тканей пульпы, предположительно на ионном уровне. Схематично это можно изобразить: пульпа → дентин → эмаль. И включение местной иммунной системы в развитие патологического процесса может происходить только посредством влияния пульпы зуба на дентин и эмаль.
5. Заключение
В результате воздействия различных видов стресса на организм крысы происходит дисбаланс, приводящий к патоморфологическим изменениям в тканях пульпы зуба, которые носят пролиферативно-дистрофический характер. Наблюдается пролиферативное воспаление в пульпе с размножением фибробластов и разрастание соединительной ткани. Хроническое воспаление в периодонте у крыс второй группы. Преобладание волокнистой соединительной ткани по существу рубцовой свидетельствует о повреждении клеток фибробластов.
Патоморфологические изменения, происходящие в тканях зуба и периодонта второй группы крыс, позволяют предположить, что тех средств, которые получали животные, после моделирования стресса, оказывается недостаточно для того, чтобы организм полностью справился с последствиями стрессового воздействия.