КЛИНИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ГАЛЕКТИНА-3 КАК МАРКЕРА ФИБРОЗА У ПАЦИЕНТОВ С ДИВЕРТИКУЛЯРНОЙ БОЛЕЗНЬЮ ОБОДОЧНОЙ КИШКИ
КЛИНИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ГАЛЕКТИНА-3 КАК МАРКЕРА ФИБРОЗА У ПАЦИЕНТОВ С ДИВЕРТИКУЛЯРНОЙ БОЛЕЗНЬЮ ОБОДОЧНОЙ КИШКИ
Аннотация
В течение длительного времени, с диагностической целью дивертикулярной болезни ободочной кишки (ДБОК) и её осложнений применяются стандартные лабораторные (общие и биохимические анализы крови) и инструментальные методы диагностики (компьютерная томография, ирригоскопия, колоноскопия и ультразвук). Вместе с тем в последние годы отмечается стремительный рост этой патологии, сопровождающейся серьезными осложнениями, что диктует необходимость поиска новых биологических маркёров, которые могли бы применяться в качестве факторов, раскрывающих механизм развития заболевания и предикторов диагностики на разных этапах заболевания. Целью настоящего исследования является определение роли галектина-3 (Gal-3) в патогенезе, диагностике и прогнозе течения ДБОК. В рамках исследования проводили иммуногистохимические и иммуноферментные анализы, определяя экспрессию Gal-3 в стенке ободочной кишки (ОК) и содержание его в крови пациентов с дивертикулярной болезнью ободочной кишки, которые являлись объектами исследования.
Экспрессия Gal-3 в образцах тканей стенки кишки (без дивертикулов, с дивертикулами без осложнений и с осложнёнными дивертикулами) у пациентов с ДБОК выше, чем у пациентов с раком ободочной кишки и долихоколоном. Средний уровень галектина-3 в плазме крови пациентов с ДБОК превышает норму в отличие от пациентов с раком ободочной кишки и долихоколоном. Средний уровень Gal-3 в плазме крови пациентов с ДБОК остался без изменений. Следовательно, все эти факты подтверждают связь Gal-3 с процессом формирования фиброза в стенке ободочной кишки, что является предпосылкой для образования в ней дивертикулов.
1. Введение
Неутешительные хирургические данные последних лет показывают повсеместный очевидный стремительный рост ДБОК с непонятным патогенезом. Вместе с тем увеличивается число её тяжелых осложнений, требующих применения более точных и конкретных методов диагностики. По различным источникам, ДБОК страдают около 10% людей в возрасте до 40 лет, около 50% старше 50 лет и почти 70% в возрасте 80 лет и старше , . Из известных факторов, влияющих на патогенез ДБОК, можно выделить: неправильную диету с низким содержанием клетчатки, что приводит к изменению моторно-эвакуаторной функции кишки с преобладанием запоров; типичное изменение состава микрофлоры; повышение внутрипросветного давления и другие менее доказанные факторы, такие как низкий уровень инсоляции и гиповитаминоз D , , .
Традиционно, с диагностической целью ДБОК и её осложнений применяются лабораторные методы (общие и биохимические анализы крови) и инструментальные методы (компьютерная томография, ирригоскопия, колоноскопия и ультразвук). В совокупности эти методы могут обеспечить необходимые условия для ранней диагностики ДБОК, её прогноза клинического исхода, деления пациентов в зависимости от стадии заболевания и мониторинга эффективности проводимого лечения (терапевтического или хирургического). Среди других причин, вызывающих развитие ДБОК, принято считать врождённые коллагенозы, обусловленные наследственными (генетическими) нарушениями структуры коллагена или обмена веществ (синдромы Марфана и Эйлерса-Данлоса). К сожалению, ни один из существующих методов не может проникнуть в корень механизма развития ДБОК, подтверждая или опровергая эти факторы и их роль в её патогенезе. Вместе с тем, с учётом инноваций в медицине, стало возможным оценивать патологические изменения в организме, определяя биологические маркёры, связанные с ними.
На нынешнем этапе клинической практики идет поиск биологических маркёров, которые могли бы применяться в качестве факторов, раскрывающих механизм развития заболевания и предикторов, предполагающих присутствие заболевания. Среди этих маркёров Gal-3 с особенной структурой коллагеноподобного участка, позволяющего ему связываться с так называемыми протеинами экстрацеллюлярного матрикса, такими как фибронектин, тенасцин и ламинин. Gal-3 с молекулярной массой 26 СкДа выполняет разные функции в организме в зависимости от его локализации по отношению к клеткам. Его внутриклеточная локализация ингибирует апоптоз, а внеклеточная локализация наоборот вызывает смерть клеток своим воздействием на иммунную систему интенсифицируя процессы воспаления и фиброза , , . Кроме того, Gal-3 стимулирует активацию фибробластов, производящих коллаген, и активацию ростового фактора β с последующим развитием фиброза , , .
Цель — определить роль Галектин-3 в патогенезе, диагностике и прогнозе течения дивертикулярной болезни ободочной кишки.
2. Материалы и методы
Для достижения целей проводили иммуногистохимические (ИГХ) и иммуноферментные (ИФА) анализы, определяя экспрессию Gal-3 в стенке ободочной кишки и содержание биомаркера в крови пациентов с ДБОК, которые являлись объектами исследования.
Основную группу составили 34 пациента, оперированные по поводу осложненной ДБОК. В иммуногистохимическое исследование были включены 186 образцов биопсийного материала стенки ободочной кишки, взятых интраоперационно: 48 образцов тканей из стенки кишки без дивертикулов, 72 образца тканей из стенки кишки с дивертикулами без осложнений и 54 образца тканей из стенки кишки с осложненными дивертикулами.
Контрольную группу составили 8 пациентов, оперированных по поводу злокачественных новообразований без признаков непроходимости (7 образцов) и долихоколон (5 образцов). Материал для исследования у пациентов с раком ободочной кишки взят у нижнего края резекции кишки на расстоянии от 5 до 10 см от опухолей в зависимости от их локализации, а местом для забора материала у пациентов с долихоколон выбран левый фланг ободочной кишки.
Иммуногистохимическое исследование уровня экспрессии молекулярно-биологического маркера проведено с использованием поликлонального антитела Gal-3 (Cloud-Clone Corp., Китай).
Для иммуногистохимического окрашивания срезы подвергали термообработке в 0,01 М цитратном буфере (Carl Roth GmbH +Co. KG, Германия) при pH 6,0 в микроволновой печи в течение 10 мин, а затем инкубировали с 3% H2O2 в течение 10 мин для инактивации эндогенной пероксидазы. Далее в течение 30 минут при 37°С проводили инкубацию с первичным антителом Gal-3 во влажной камере 24 часа при температуре 4°С. В качестве системы визуализации использовались Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB Detection IHC Kit (Abcam), содержащие комплекс вторичных антител и хромоген диаминобензидин. Для контроля активности первичных антител в каждой серии проводили одно отрицательное и одно положительное контрольное окрашивание.
Количественную оценку экспрессии биомолекулярных маркеров выполняли путем анализа цифрового изображения, полученного с помощью микроскопа Leica DMLS с программным обеспечением (Германия) и цифровой камерой JVC (при увеличении в 100 раз), с использованием алгоритма “positive pixel count” и программы для морфометрии Aperio ImageScope. Фотографировали зоны мышечных элементов слизистой и мышечной оболочек.
Иммуноферментный анализ проводили в 3-х группах:
Первая (основная) состоящая из 34 пациентов (стаж заболевания ДБОК от 1 до 120 месяцев), среди них 17 женщин (50%) в возрасте от 33 до 73 лет со средним возрастом 54,5 ± 10,137 [Ме=54] и 17 мужчин (50%) в возрасте от 43 до 75 лет со средним возрастом 54,4 ± 8,938 [Ме=56]. Все пациенты прошли хирургическое лечение по поводу осложненной дивертикулярной болезни следующего характера: дивертикулит — 3 случая (8,8%), инфильтративная прикрытая перфорация дивертикула с развитием стеноза просвета ободочной кишки (компенсированное нарушение кишечной проходимость) — 12 случаев (35,3%), инфильтративная прикрытая перфорация дивертикула с развитием обтурации просвета ободочной кишки (декомпенсированное нарушение кишечной проходимость) — 2 случая (5,9%), абсцедирующая прикрытая перфорация дивертикула — 7 случаев (20,5%), ободочно-моче-пузырный свищ — 3 случая (8,8%), ободочно-вагинальный свищ — 1 случай (2,9%), ободочно-тонкокишечный свищ — 1 случай (2,9%), ободочной-перианальный (кожный) свищ — 1 случай (2,9%), интрамуральный не воспалительный инфильтрат со стенозом просвета кишки вследствие инвагинации слизистой в дивертикулы с частичным ущемлением — 1 случай (2,9%) и 4 случая (11,8%) дивертикулов без осложнений (пациенты прошли первый этап оперативного вмешательства по поводу осложнений ДБ, а в момент исследования поступили в стационар с колостомами для восстановительных операций).
Вторая (промежуточная) группа, состоящая из 18 пациентов из числа пациентов основной группы, находившихся под наблюдением и сдавших кровь в срок от 4 до 6 месяцев после оперативного вмешательства. Возраст колебался от 33 до 75лет, средний возраст составил 53,66 ± 7,92 [Ме=54].
Третья группа (контрольная), включала 8 пациентов, оперированных по поводу рака ободочной кишки 4 (50%) в возрасте от 49 до 82 лет со средним возрастом 64,75 ±10,25 [Ме=64] года и долихоколон 4 (50%) в возрасте от 28 до 42 лет со средним возрастом 35±4 [Ме=35] лет.
В этих группах исследовали изменение содержания в сыворотке крови галектина-3 с использованием набора Enzyme-linked Immunosorbent assay kit for Galectin-3 (Cloud-Clone Corp., Китай). Все образцы венозной крови были доставлены в лабораторию сразу после забора, где их центрифугировали в течение 10 минут при 2000g. Полученную плазму хранили при низкой температуре (- 80°С) до момента проведения исследования.
Оценку результатов иммуногистохимических реакций проводили с учетом локализации, распространенности и интенсивности окрашивания слизистой оболочки толстой кишки. При оценке локализации окрашивания обращали внимание на ядерное, цитоплазматическое, мембранное и экстрацеллюлярное окрашивание. Интенсивность окрашивания оценивали субъективно: отмечали отсутствие окраски, слабое, умеренное и сильное окрашивание. Для стандартизации оценки использовали алгоритм “positive pixel count” и программу для морфометрии Aperio ImageScope.
Результатом проведенного анализа являлись данные о распространенности и интенсивности коричневой окраски продуктов реакции ДАБ (красные поля — выраженная экспрессия, оранжевые — умеренно-выраженная, желтые — слабовыраженная, синяя и белая окраска — отсутствие экспрессии). Индекс экспрессии (ИЭ) галектина-3 рассчитывали по формуле: ИЭ = число позитивных пикселей / общее число пикселей ´100. Иммуногистохимическая оценка всегда проводилась совместно с исследованиями гистологической картины на окрашенном гематоксилином и эозином срезе. Диф. диагностика с раком:
1) цитоплазматическое окрашивание клеток СО и воспалительных клеток — доброкачественный процесс;
2) окрашивание ядер СО и экстрацеллюлярного матрикса — злокачественный.
Критерии включения пациентов в исследование:
– основная группа — осложненная дивертикулярная болезнь ободочной кишки, которая требовала хирургического лечения, липидный спектр (общий холестерин, липопротеины высокой плотности, липопротеины низкой плотности и триглицериды) в пределах нормы, независимо от приема препаратов, регулирующих эти показатели;
– контрольная группа — опухоли ободочной кишки без признаков непроходимости, долихоколон с субкомпенсированной стадией.
Критерии исключения пациентов из исследований: сахарный диабет, инфаркт миокарда в анамнезе, рак щитовидной железы, любой тип гепатита, цирроз печени. Кроме того, из основной группы исключили пациентов с полипами и злокачественными новообразованиями толстой кишки, а из контрольной группы исключили пациентов с другой локализацией злокачественных новообразований.
Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием пакета статистических программ «STATISTICA12.0» (Version10-Index, StatSoftInc., США). Отличные от нормального распределения результаты описывали в виде медианы (Ме), интервала между 25 и 75 процентами. Для определения статистической значимости различий между группами использовали ранговый анализ вариаций U-критерий Манна-Уитни, ранговую корреляцию Spearman, критерий Wilcoxon, также критерий box and whisker plot. Различия считались достоверными при р<0,05. За нулевую гипотезу принималось утверждение, что наблюдаемые различия между одноименными признаками в исследуемых группах находятся в пределах случайных отклонений, т.е. различия не достоверны.
3. Результаты и их обсуждение
Галектин-3 при иммуногистохимическом окрашивании обнаруживался в ядрах и цитоплазме клеток слизистой оболочки, а также образовывал паттерны в экстрацеллюлярном матриксе. Сильная экспрессия Galectin-3 отмечалась в очагах умеренной и выраженной лимфоцитарной инфильтрации. Также выраженная и умеренная экспрессия галектин-3 наблюдалась в зонах фиброза и фиброплазии.
Данные ИГХ исследований показывают неоднородность окрашивания (Gal-3) в тканях ободочной кишки с дивертикулами (рис. 1).
Рисунок 1 - Экспрессия галектина-3 в различных участках стенки ободочной кишки при ИГХ:
a) однородное умеренное иммуноокрашивание галектина-3 в кишечном эпителии крипт и выраженное иммуноокрашивание галектина-3 в поверхностном эпителии слизистой оболочки ободочной кишки пациента с долихоколон (контрольная); b) однородное распределение умеренно и, очагово, сильного позитивного иммуноокрашивания галектина-3 в слизистой оболочке ободочной кишки у пациента с дивертикулярной болезнью (стенка кишки без дивертикулов); c) выраженное иммуноокрашивание галектина-3 в поверхностном эпителии и эпителии крипт слизистой оболочки стенки ободочной кишки в зоне дивертикулов без осложнений; d) заметно пятнистое и неоднородное эпителиальное иммуноокрашивание, сильно позитивные клетки к галектину-3 чередуются с нереактивными клетками стенки ободочной кишки в зоне осложненных дивертикулов
Таблица 1 - Числовые значения экспрессии Gal-3 в различных тканях ободочной кишки
№ п/п | Группы | Индекс экспрессии % Me (25;75) | Доверительный интервал 95% | Разница |
1 | Контроль | 14,45 (13,26; 16,31) | (1,39; 2,78) |
|
2 | Стенка без дивертикулов | 18,95 (16,9; 21,61) | (3,8; 5,02) | Р1-2<0,05
|
3 | Дивертикулы без осложнений | 21,13 (18,12; 24,93) | (4,81;5,79) | Р1-3<0,05 |
4 | Осложненные дивертикулы | 19,93 (17,16; 22,95) | (4,04; 5,31) | Р1-4<0,05 |
Наблюдаемая неоднородность ИГХ окрашивания может быть связано с несколькими факторами, включая биологические свойства самого белка и особенности патологического процесса. При остром воспалении в зонах активного воспаления макрофаги и нейтрофилы активно экспрессируют Gal-3, вызывая сильное окрашивание. После разрешения воспаления эпителий может терять Gal-3, так как его экспрессия часто ассоциирована с пролиферацией и повреждением (например, при регенерации). В дивертикулах нарушена микроциркуляция, что приводит к зонам ишемии и активации Gal-3 в ответ на стресс. Реорганизованный эпителий может замещаться рубцовой тканью или изменять фенотип, теряя способность синтезировать Gal-3. Таким образом, неоднородность окрашивания отражает динамику воспаления (активная фаза или хроническое воспаление).
Gal-3 стимулирует пролиферацию и активацию фибробластов, способствуя их трансформации в миофибробласты — основные клетки, ответственные за синтез экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ). Способствует поляризации макрофагов в профибротический M2-фенотип, который выделяет TGF-β и другие профибротические цитокины. Gal-3 усиливает TGF-β-зависимую сигнализацию, что приводит к увеличению продукции коллагена и фибронектина. Gal-3 взаимодействует с компонентами ЭЦM (коллагеном, фибронектином, ламинином), стабилизируя их и препятствуя деградации. Это приводит к увеличению отложения коллагена, нарушению баланса между матриксными металлопротеиназами и их ингибиторами, что способствует фиброзу. Gal-3 может способствовать эпителиально-мезенхимальному переходу, при котором эпителиальные клетки приобретают мезенхимальные свойства, усиливая фиброз
Мы видим, что экспрессия галектина-3 происходит во всех образцах тканей из стенки кишки в исследуемых группах, но более выражено в тканях ободочной кишки пациентов с дивертикулярной болезнью, то что указывает на наличие фиброза и воспаления в этих зонах. Кроме того, полученные числовые значения при ИГХ могут показывать наличие умеренного процесса фиброза в стенке кишки без дивертикулов, выраженный процесс (пик) фиброза в зоне дивертикулов без осложнений и в зоне осложненных дивертикулов тяжелый процесс фиброза (склероз) вследствие нарушения тканевой структуры клеток стенки кишки и её ремоделирования.
Следовательно, процесс, происходящий в стенке ободочной кишки при ДБ, можно охарактеризовать следующим образом:
1) в стенке ободочной кишки без дивертикулов (умеренный процесс фиброза + воспаление низкой интенсивности);
2) в зоне дивертикулов без осложнений (выраженный процесс фиброз + воспаление умеренной интенсивности);
3) в зоне осложненных дивертикулов (тяжелый процесс фиброза (склероз) + воспаление тяжелой интенсивности (осложнение дивертикулярной болезни в виде дивертикулита, прикрытой перфорации или свищей)).
Полученные данные ИФА, проведенного для изучения уровни Gal-3 в плазме крови двух групп основной (1-ая) до оперативного вмешательства по поводу осложненной ДБОК и контрольной (3-ая) по поводу рака ободочной кишки и долихоколон показали: средний уровень Gal-3 в крови пациентов 1-й группы составил 3,23 (2,78;4,01) нг/мл, что значительно выше (р<0,05) чем у пациентов 3-й группы, который составил 1,22 (0,11; 2,15) нг/мл (рис. 2) (в плазме крови здорового человека уровень Gal-3 составляет 0–2,28 нг/мл). Вместе с тем этот непараметрический критерии Mann–Whitney, применявшийся для сравнения двух независимых групп (1 и 3 группы), доказал наличие сильного статистического различия между ними, где u=0,0001, p=0,000014, что показывал критерий box and whisker plot (рис. 2).
Рисунок 2 - Уровень Gal-3 в крови пациентов основной и контрольной групп
Высокий уровень Gal-3 в плазме крови пациентов с ДБОК говорит об его активном участии и тесной связи с процессом фиброза в стенке кишки и нарушении ее клеточной структуры, что делает из галектина-3 важным маркером в диагностике и прогностическом развитии дивертикулярной болезни.
Сравнительный анализ уровня Gal-3 в плазме крови 18 пациентов из основной группы, до оперативного вмешательства, который составил в среднем 3,23 (2,78; 3,95) нг/мл и после него 2,99 (2,81; 3,3) нг/мл в сроке 4–6 месяцев (рис. 3) показал визуальное слабое снижение уровня Gal-3 в плазме крови пациентов в послеоперационном периоде. Но при этом следует отметить, что все значения у этих пациентов оставались выше нормы. Критерий Wilcoxon (Z = 1,49; P = 0,136) также показывал отсутствие статистического отличия между ними, что подтверждается критерием box and whisker plot (рис. 3).
Отсутствие статистического отличия между двумя группами (1 и 2) ещё раз подтвердило связь Gal-3 с ДБОК и его активную роль в процессе фиброза. Незначительное снижение его уровня в послеоперационный период указывало на отсутствие воспалительного процесса и дивертикулов в оставшейся части ободочной кишки, учитывая тактику операции, заключавшуюся в удалении всех сегментов ободочной кишки, вовлечённых в процесс, включая как осложнённые, так и неосложнённые дивертикулы.
Подсчет ранговой корреляции Spearman позволил установить отсутствие корреляционной связи между уровнем Gal-3 и возрастом пациентов [Rs = 0,156107] и продолжительностью заболевания [Rs = 0,162475] при ДБОК. Было проведено исследование на нелинейность характера протекания снижения галектина-3 и выхода его уровня на плато (стагнация) за период времени 4–6 месяцев после операций, следовательно, мы не нашли корреляционную связь между уровнем галектина-3 и продолжительностью заболевания с учетом того, что у разных пациентов стаж заболевания составил от 1 до 120 месяцев. На рисунке 3 виден график близкий к линейному с девиацией, отклонение исследуемого параметра не превышает 20%.
Рисунок 3 - Уровень Gal-3 в крови пациентов основной и промежуточной групп
4. Заключение
В настоящее время доказано, что галектин-3 участвует во множестве процессов жизнедеятельности клеток, включая регуляцию клеточного цикла и передачу межклеточного сигнала. Кроме того, он играет роль медиатора клеточной трансформации и воспалительного процесса. Наши исследования (впервые изучается клиническая значимость Gal-3 при ДБОК) показали, что Gal-3 в образцах тканей стенки кишки (без дивертикулов, с дивертикулами без осложнений и с осложнёнными дивертикулами) у пациентов с ДБОК выше, чем у пациентов с раком ободочной кишки и долихоколон. Средний уровень Gal-3 в плазме крови пациентов с ДБОК превышает норму в отличие от пациентов с раком ободочной кишки и долихоколон. В сроке 4–6 месяцев в послеоперационном периоде средний уровень Gal-3 в плазме крови пациентов с ДБОК претерпевал незначительное снижение, но остался выше чем у пациентов с раком ободочной кишки и долихоколон. Таким образом, полученные результаты указывают на роль Gal-3 в процессе фиброзирования стенки ободочной кишки, что является предпосылкой для образования в ней дивертикулов, и обусловлено, предположительно, генетическим фактором. Основываться только на своих исследованиях для подтверждения или опровержения генетического фактора процесса фоброзирования нецелесообразно, поэтому необходимо проведение дополнительных исследований в этом направлении.